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CAR-T細胞質檢邁入單分子時代

北京同立海源生物科技有限公司2019年8月19日 11:14 點擊:425

單細胞單分子CAR基因拷貝數的定量

CAR-T細胞療法(Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy)是一種體外轉化人源T細胞使之成為靶向治療癌癥的新型免疫療法。自諾華的Kymriah和Gilead的Yescarta成功獲批以來,CAR-T已成為最具前景的腫瘤療法之一,不但很多難治的血液腫瘤可以得到很好的治療,很多固體瘤的CAR-T治療也在臨床前研究階段取得突破性的進展。


然而作為一項還在不斷進化中的癌癥治療技術,其復雜難控的生產流程和早期的巨大研發投入等諸多因素使得這種癌癥治療依然非常昂貴,一個療程動輒幾百萬人民幣。即便如此先進的細胞治療技術也會產生諸如細胞因子釋放綜合征(Cytokine ReleaseSyndrome)這樣的副作用,這些都為上游CAR-T細胞的生產和病人回輸以后的預后監控帶來新的技術挑戰。如何能夠保證不同批次生產的CAR-T細胞質量一致,如何獲知病人體內是否長期攜帶輸入的癌癥靶向性CAR-T細胞都是整個細胞治療行業值得深挖和解決的問題。


為了這個問題,德國國家腫瘤中心主任Dirk J?ger教授的實驗室開始嘗試用德國圖維生物科技有限公司(PixelBiotech GmbH的新型單分子技術HuluFISH來測試CAR基因在單細胞水平上的表達情況。經過PixelBiotech公司的探針設計,基于CAR基因胞外scFV序列的探針文庫被用于單個CAR基因mRNA分子的檢測。初步實驗(圖1)表明HuluFISH CAR探針可以準確地檢測到人源T細胞中CAR基因的單分子表達水平,結果顯示出即使來自世界一流CAR-T實驗室生產的細胞也存在著極大的表達異質性,而該異質性恰恰是影響CAR-T細胞批次差異的關鍵指標,是其他傳統技術如qPCR所不能反映的指標。


基于HuluFISH的CAR單分子mRNA檢測

圖1基于HuluFISH的CAR單分子mRNA檢測。染色基于人源CAR-T細胞,每個黃色圓點代表一個CAR mRNA分子,藍色背景為細胞核染色,黃色箭頭所指為單個CAR基因mRNA分子的示例。

 

該實驗室CAR-T項目組負責人Patrick Schmidt博士也對此次嘗試提出了自己的看法和期待:

“To test and define a new successful CAR product it is very important to monitor it’s persistence in the body. We are currently evaluating and developing PixelBiotech’s HuluFISH method in our pre-clinical research. It promises not only a CAR detection requiring very low amount of body liquid (blood, liquor, lymph) but also for the first time ever a molecular quantification in a single CAR positive cell. This novel method will therefore give us the opportunity to investigate our cellular treatments more specifically and more sensitive. We are hopeful that HuluFISH will become a standard detection method for CARs at the patient bed-side.”

“為了測試和確定CAR-T細胞產品是否成功,能夠檢測其在體內長期存在的情況非常關鍵。我們目前正在臨床前研究中驗證和開發基于PixelBiotech公司的HuluFISH方法。該方法不僅可以通過極微量的樣本(血液,腦脊液,淋巴液)就可以檢測CAR,而且可以第一次讓我們在單個CAR陽性細胞中進行分子定量。這種新型方法可以讓我們更加特異、靈敏地研究我們各種新型的細胞治療。我們希望HuluFISH能夠成為臨床病人CAR檢測的一種標準方法?!?/span>

 

進一步的圖像分析是通過PixelBiotech公司的HuluREAD軟件來實現的全自動人工智能圖像分析,結果顯示了很小的單分子定量實驗批間差異(圖2),單個人源T細胞的CAR表達量從2個mRNA到72個mRNA分子廣泛分布,平均表達量是每個人源T細胞27.5個mRNA分子。

CAR基因單分子定量分析

圖2. CAR基因單分子定量分析。三次獨立實驗的定量結果分別用三個violin plot顯示。不同散點來自不同T細胞的CAR基因單分子絕對表達量。

 

同批次CART細胞的FACS定量結果

圖3. 同批次CART細胞的FACS定量結果。轉染后第12天(d12)的陽性率達93.6%。

 

通過和同一批次的CART細胞蛋白質定量結果對比(FACS定量結果如圖3),HuluFISH的單分子測量表現出很好的重現性。單分子CAR基因mRNA絕對定量的結果很好地解釋了FACS結果中的熒光強度范圍大不僅僅是檢測器的波動,更多地來自于CAR基因本身的表達異質性。


本次實驗是在德國圖維生物科技有限公司(PixelBiotech),德國國家腫瘤中心,北京義妙神州醫療科技有限公司和北京同立海源生物科技有限公司共同設計合作進行的。數據版權所有者為德國圖維生物科技有限公司。北京同立海源生物科技有限公司為德國圖維生物科技有限公司(PixelBiotech)中國授權代理商,如有技術問題請與公司聯系。

 

德國圖維生物科技有限公司

德國圖維生物科技公司(www.pixelbiotech.com)致力于提供領先的單分子生物標志物定量解決方案,用于癌癥早期和精準診斷,病源微生物、病毒快速診斷,單細胞基因組學數據垂直驗證,疫苗和食品安全質控等領域。公司目前產品有全球基于酶學方法合成的多色熒光標記探針文庫技術HuluFISH,基于人工智能的全自動生物標志物三維圖像分析方法HuluREAD,以及為工業客戶定制推出的HuluFISH檢測深度定制開發服務HuluLAB。 

 

德國國家腫瘤中心

國國家腫瘤中心致力于提供一流的癌癥治療。該中心的目標是為所有復發的癌癥病人提供各種臨床I期的實驗性治療。各種實驗性治療中,細胞免疫療法包括CAR-T細胞治療是重要的研究治療方向。國國家腫瘤中心科研成果已經得到了廣泛的臨床和科研認可。國國家腫瘤中心的科學家在過去的10年內獲得了兩次諾貝爾獎。

 

北京義妙神州醫療科技有限公司

義妙神州具有多年癌癥、免疫的基礎研究和轉化醫學研究經驗,在國際期刊發表多篇高水平學術論文,掌握多項CAR-T核心技術。致力于將CAR-T技術和基因細胞藥物應用于惡性腫瘤治療。已經具備并且將持續擴大世界一流的基因細胞藥物研發團隊,始終堅信創新的研發是公司的核心驅動力。

 

北京同立海源生物科技有限公司

同立海源生物,10余年來專業從事真核表達平臺GMP級重組蛋白、單克隆抗體、藥物靶點蛋白、細胞培養試劑盒的研發和生產,產品主要涉及免疫學、細胞生物學、腫瘤、干細胞等相關生命科學領域的研究,并致力生物技術藥物如納米抗體、單克隆抗體、重組蛋白藥物等研究開發與技術服務。


(來源: 北京同立海源生物科技有限公司


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