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【干貨+試用】一文get核酸片段化酶知識要點

上海翊圣生物科技有限公司2019年8月5日 3:29 點擊:442

                            

【干貨+試用】一文get核酸片段化酶知識要點

最近小翊在后臺收到一封留言,說建庫的片段化儀器壞了,不能做超聲打斷,問有沒有其他核酸打斷的方法推薦。

核酸打斷的方法可以分為機器法和試劑法。其中機器法包含接觸式和非接觸式,接觸式主要包括探頭式和水浴超聲兩大類,這類方法比較實惠,但是直接接觸樣本會導致樣本損耗和污染,非接觸式主要包括Diagennode和Covaris這兩個品牌,這類儀器和耗材的成本太高,單個樣本的耗材成本達20-50元。試劑法指的是采用片段化酶對核酸進行打斷,這類方法成本較低,操作簡便省時,只需要在樣本中加入片段化酶,再反應一段時間即可完成反應。市面上報道可用于核酸打斷的片段化酶有很多,包括應用于高通量測序的Tn5轉座酶、NEB公司推出的Fragmentase、DNase I和Endonuclease V等。這里小翊就借花獻佛,將試劑法核酸片段化酶的資料整理出來與大家分享。

DNase

DNase I(Deoxyribonuclease I):中文名稱為脫氧核糖核酸酶I,是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈寡脫氧核苷酸的核酸內切酶。DNase I水解單鏈或雙鏈DNA后的產物,5'端為磷酸基團,3'端為羥基。DNase Ⅰ酶切底物DNA通常依賴于鈣離子,并能被鎂離子或二價錳離子激活。

常見應用:

RNA樣本中DNA的消化

體外轉錄后去除模板DNA

通過切口平移與DNA聚合酶I一起進行DNA標記

dsDNA酶切,生成隨機的DNA文庫

鎂離子存在條件下,DNase I隨機剪切雙鏈DNA的任意位點;二價錳離子存在條件下,DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈,形成平末端,或1-2個核苷酸突出的粘末端。

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DNase Ⅰ在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA。圖片來源于Thermo

 

DNase Ⅰ在不同的離子存在下可以片段化dsDNA,然后實際操作中卻易受到多種條件的影響,如酶的用量,反應溫度,底物DNA的純度等。此外研究發現DNase Ⅰ對嘧啶核苷酸旁邊位點有偏好性,大大影響終文庫的多樣性[1]。

Endonuclease V

核酸內切酶 V 是E. coli 中發現的一種 DNA 修復酶。其識別脫氧肌苷(脫氧腺苷在DNA中的脫氨基產物),對錯配的脫氧肌苷3′ 端第二個磷酸二酯鍵進行切割,產生一個 3′ 羥基、5′ 磷酸的切刻。除此之外在較小程度上可以識別AP位點,基因錯配的DNA位點,插入/缺失不匹配等位點。

常見應用:

突變研究

DNA修復

錯配剪切

基因分型

DNA重組

 

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Endonuclease V可識別AP位點或尿素、堿基錯配、插入/缺失錯配、發夾結構的 DNA。圖片來源于Thermo

2002年,日本學者Kentaro Miyazaki使用Endonuclease V用于DNA樣本的隨機片段化。由于Endonuclease V可特異性識別尿嘧啶,因而可以通過調節DNA中尿嘧啶的殘留量來控制最終Endonuclease V酶切的長度。結果表明在沒有dUTP的情況下,DNA不會被酶切(Lane 1),當dTTP/dUTP的比例降低時,片段的平均長度也隨之降低(Lane 2,3,4),當dUTP完全替代dTTP的時候,DNA會被切割的很短(Lane 5[1]。

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不同的dTTP/dUTP濃度比例條件下,DNA被酶切后的片段分布電泳圖

Endonuclease V一般識別特定的位點,本研究中通過PCR隨機引入尿嘧啶可用于DNA的隨機片段化。由于堿基序列組成的差異,樣本的GC含量對Endonuclease V片段化效果有潛在影響,實際操作中尤其是NGS應用中也會受到諸多條件的限制。

dsDNA Fragmentase

dsDNA FragmentaseNEB公司推出的一款片段化酶,以單酶的形式出售。該產品實際上是兩種酶按一定比例組合成的混合酶體系,一種酶在DNA雙鏈上隨機產生缺刻,另一種酶識別這個缺刻并在互補鏈上切割,從而產生DNA雙鏈斷裂。Fragmentase進行雙鏈DNA片段化反應后產生帶有5’磷酸和3’羥基的短突出粘性末端DNA片段。

該酶通過改變酶切時間將DNA酶切至特定大小的DNA片段,與初始的Input DNA量以及Input DNA長度無關。

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不同起始量的gDNA不同酶切時間后的片段分布。圖片來源于NEB官網

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不同長度的gDNA不同酶切時間后的片段分布。圖片來源于NEB官網

Tn5

NexteraXT技術相信大家都不陌生,20111月,Illumina宣布收購Epicentre生物技術公司,于是理所當然的Epicentre公司的Nextera技術核心也歸illumina公司所有。

NexteraXTP5/P7端部分接頭序列和轉座子末端序列形成包被接頭與Tn5形成轉座復合體,該復合體會打斷受體DNA,形成一端帶有P5部分的Adapter1,一端帶有P7部分Adapter2的DNA,之后通過PCR加上index序列以及接頭其余部分,形成完整的文庫,整個建庫流程僅需90 min。

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Tn5轉座酶建庫原理示意圖

Tn5也借此引爆極速建庫之戰,而競爭對手也并沒有坐以待斃,Thermo用Mu轉座酶推出了Museek Library Preparation Kit for Ion Torrent;Agilent 推出Vibrio(哈式弧菌),Vibrio與Tn5序列之間的相似性高達40%。盡管如此,其市場反饋以及實際情況都不如Tn5。

同時Tn5由于其片段化的偏好性經常受到競爭對手的詬病。據統計Tn5在插入位點兩側9個堿基左右有明顯的偏好性。

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轉座酶插入位置前后9堿基左右有明顯的偏好性。圖片來源于網絡

片段化酶小結

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片段化酶與NGS

NGS因其檢測靈敏度高,特異性高且兼具定性和定量檢測,在NIPT,腫瘤基因突變,PGD/PGS等領域展現了極為廣闊的臨床與科研應用前景。

然而受限于平臺測序讀長短的不足,建庫前需隨DNA進行隨機打斷。目前主要是以機械法為主(如Covaris),但是超聲本就是物理方法打斷,會對DNA造成明顯的損傷,且超聲儀器與耗材成本居高不下,這對競爭激烈的NGS下游服務企業來說,成本太過高昂。因而這也將是以片段化酶+常規建庫試劑搭配的酶切法建庫試劑盒進入市場的重要契機。

對于不同的片段化酶來說,Tn5依然是目前市場上極速建庫的王者,然而另一方面Tn5在建庫中所表現出的偏好性也使得不少的客戶望而卻步。因此像DNase Ⅰ、Endonuclease Ⅴ以及Fragmentase在市場上初露鋒芒,其中DNase Ⅰ與Endonuclease Ⅴ因其各自的不足尚未被完全開發利用,Fragmentase則是目前NGS端最為大眾所熟知的片段化酶。

 

 

精品推薦

翊圣生物結合自身分子酶的創新研發,推出片段化酶Smearase,本產品酶切效果僅與酶切時間有關而與樣本類型GC含量以及Input DNA無關。以此為核心的酶切法建庫試劑盒Hieff NGS? OnePotⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina擺脫了繁瑣的超聲過程,同時簡化了操作流程,極大的降低了建庫的時間和成本。并且針對FFPE樣本也能獲得優異的測序結果。

產品特點:

1、操作簡便:片段化/末端修復/加A一步完成

2、穩定酶切:酶切效果僅與時間有關,不受物種類型與Input DNA影響

3、偏好性低:酶切偏好性遠低于Tn5

4、適用范圍廣:不僅適用于常規gDNA,cDNA,還適用于FFPE等樣本

 

 

 

 

性能展示:

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不同酶切時間后樣本片段分布情況

訂購/試用裝信息:

類型

名稱

貨號

規格

價格/元

試劑盒

Hieff NGS? OnePotⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina?

12204ES08

8 T

3683.00

12204ES24

24 T

7583.00

12204ES96

96 T

28663.00

片段化酶

Hieff? Smearase

12907ES08

8 T

563.00

12907ES24

24 T

1263.00

12907ES96

96 T

4663.00

參考文獻:

Miyazaki K. Random DNA fragmentation with endonuclease V: application to DNA shuffling. Nucleic Acids Res. 2002 Dec 15;30(24):e139.

                                                                                                                                         

                                                                                                                                                                      HB190731



(來源: 上海翊圣生物科技有限公司


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